1）常见的原因是该蛋白在使用的细胞（系）里的表达丰度低，建议使用该蛋白表达丰度高的细胞系做阳性对照来排除这种可能。
2）在技术层面上，抗体浓度或稀释比例不当或抗体组合不当、细胞固定或封闭不充分、固定液存放时间过长等原因也可能导致荧光信号弱。这类问题可以通过调整抗体浓度或稀释度或更换抗体组合、优化固定或封闭步骤、重新配制固定液等方法来解决。
3）细胞固定或处理不当。不同的处理方法会导致细胞呈现不同的抗原表位，抗体在某种处理条件下工作不代表它会在另一种处理条件工作。
1）靶蛋白在使用的细胞（系）里的表达丰度低：为了得到足够的荧光信号，在显微镜照相的时候往往会增加曝光的时间或加大激发光的输出强度，这些措施都会导致未经洗脱的非特异性结合的荧光信号被放大。
2）封片时有气泡或因蒸发导致封片干燥：抗淬灭封片剂如果使用不当会造成气泡排不出来，细胞染色放置时间过久会造成封片剂的蒸发也导致部分染色区域干燥。如果显微照相选取的部位位于上述区域，背景信号会很高。
3）细胞染色的时候如果一抗或二抗的浓度过高或染色过程中清洗不干净，也会导致背景信号高。
1）常见的原因是该蛋白在使用的细胞（系）里的表达丰度低，建议使用该蛋白表达丰度高的细胞系做阳性对照来排除这种可能。
2）在技术层面上，抗体浓度或稀释比例不当或抗体组合不当、细胞固定或封闭不充分、固定液存放时间过长等原因也可能导致荧光信号弱。这类问题可以通过调整抗体浓度或稀释度或更换抗体组合、优化固定或封闭步骤、重新配制固定液等方法来解决。
3）细胞固定或处理不当。不同的处理方法会导致细胞呈现不同的抗原表位，抗体在某种处理条件下工作不代表它会在另一种处理条件工作。
首先，您可以根据实验需求选择单克隆抗体或者多克隆抗体，其次，善本生物列出了每种抗体经过验证的种属和应用，并且展示相应的数据，您可以通过善本生物官网上的数据，选出您的应用或种属所需抗体，也可以通过邮件或者电话联系技术支持帮助您选择适合您实验目的的抗体。
善本生物对抗体进行不同的种属和应用验证，未列出的应用和种属是该产品不适用或者未经检测的，您可以尝试在其它物种、应用中使用该抗体，但善本生物不能保证它一定会工作。
以下几点建议供您参考：
（1）特异性与灵敏度： 单克隆抗体通常具有高度特异性，识别单一抗原表位，因此在Western blotting实验中往往产生单一、清晰的条带，有助于精确鉴定目标蛋白，减少非特异性结合。这对于需要高特异性和低背景的研究尤其重要。多克隆抗体识别多个表位，可能会产生多条带，虽然特异性相对较低，但在某些情况下可以提高检测的灵敏度，特别是当目标蛋白的表达水平很低时，多克隆抗体可能因为能够结合多个表位而捕获更多信号。
（2）物种和样品类型： 如果选用的研究对象是小鼠、大鼠等模式生物，目标蛋白的序列已知且与其他物种差异较大，单克隆抗体可能是更好的选择。对于不常见或进化上较远的物种，或者目标蛋白保守性很高，多克隆抗体可能因其能够识别多个保守表位而更合适。
（3）预算考虑： 单克隆抗体的生产成本通常高于多克隆抗体，因此价格也较高。如果预算充足，追求实验的高特异性与重复性，单克隆抗体是首选。如果预算有限，且实验对特异性要求不是特别高，多克隆抗体可以作为经济实惠的选择。
（4）实验目的与要求： 如果实验强调精确的定量分析，单克隆抗体的特异性优势更为重要。若是初步筛查或验证实验，多克隆抗体可能足够满足需求。
在Western blotting实验中，一抗的孵育时间和温度可以根据具体情况和实验条件进行调整。通常情况下，一抗室温孵育1-4 h代替4℃孵育过夜是可以的，但这种改变可能会影响抗体的结合效率和特异性以及实验的最终结果。对于低丰度或低亲和力的抗体-抗原相互作用时，4℃孵育过夜将产生更高效、更特异的结合。除特殊说明，善本生物所有结果均采用的是一抗4℃孵育过夜。
脱脂奶粉和BSA是最传统、使用最广泛的两种封闭液，市面上也有很多不同类型的快速封闭液，您可以根据您的实验需求进行选择，没有任何一种封闭液适用于所有的Western blotting!
对于大分子蛋白（＞200 kDa），建议转膜液中加入0.1%SDS，甲醇浓度调至5-10%，用湿转法代替半干法转膜，并增加转膜时间为2-3 h；对于小分子蛋白（＜20 kDa），建议转膜液中不含SDS，甲醇浓度20%，选用0.2 μm PVDF膜，转膜时间1-2 h。
建议细胞样品20-50 μg/泳道，组织样品50-100 μg/泳道，纯化的蛋白10-100 ng/泳道。