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免疫印迹分析，即Western blot分析/Western blotting，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，用于检测和分析特定蛋白质在生物样本中的表达情况。实验开始时，蛋白质混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）根据分子量进行分离，分离后的蛋白质通过电转移至固相载体（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上，形成稳定的抗原-载体结合体。随后，用一抗（第一抗体）进行孵育，它们是针对目标蛋白特定表位的特异性抗体。一抗与目标蛋白的结合是一个高度特异性的过程，确保了只有目标蛋白被识别和捕获。接下来，二抗（第二抗体）被加入到系统中。二抗通常是针对一抗的Fc区域的抗体，并且它们带有可以产生信号的标记，如酶或荧光分子。二抗与一抗的结合进一步增强了检测系统的灵敏度，它们可以放大信号，使得目标蛋白的存在可以通过可视化的方式被检测到。最后，通过适当的底物反应，如化学发光或荧光显色，目标蛋白的位置和强度在膜上被可视化，从而实现对目标蛋白的定性和半定量分析（图1）。图1  Western blot分析流程图

该实验的关键步骤是利用特异性“一抗”与目标蛋白上的抗原表位结合，一抗的选择对结果准确性至关重要。理论上，抗体通过特异性结合位点与抗原的相应表位结合，实现特异性识别 (Xu et al., 2022)。那么，为什么Western blot分析实验有时会存在多种条带呢？这是否说明抗体的特异性不好呢？实际上，这一现象并不一定直接归咎于抗体特异性不高，而是涉及一系列复杂的原因。除抗体特异性之外的其他常见的原因有以下几点：

1、翻译后修饰

很多蛋白质在翻译后会经历各种修饰，如磷酸化、糖基化、泛素化等 (Xu et al., 2023)，这些修饰可能会改变蛋白质的迁移率，导致在凝胶电泳中出现多个不同大小的条带。如CD147蛋白（Cluster of differentiation 147），理论分子量为42 kDa，它是一种高度糖基化的跨膜蛋白，在Western blot分析中会在38-70 kDa位置显示多条带（图2）。

图2  糖基化修饰使CD147出现多条带

2、蛋白剪切

很多蛋白质在翻译后的成熟过程中需要经过特定的剪切或切割步骤，从而转变为具有生物活性的状态。例如，Caspase-9蛋白是细胞凋亡途径中的一种关键酶，以人源细胞为例，在正常细胞中，它以无活性的前体形式（Pro-caspase-9）存在，前体分子量约为47 kDa。当细胞受到凋亡信号刺激时，Caspase-9前体在其特定的天冬氨酸残基（Asp315-Asn316）处被切割激活，裂解成两个片段，分别是大约37 kDa的N端片段和大约35 kDa的C端片段。这两个片段再通过非共价键结合形成有活性的同源或异源二聚体，进而激活下游系列Caspases蛋白如Caspase-3、-6和-7等。因此，由Western blotting结果可看到，针对Caspase-9的抗体，可能会识别到全长的Caspase-9前体条带和剪切后的两个条带（图3）。

图3  Caspase-9抗体识别Caspase-9前体和剪切体

3、目标蛋白存在多种亚型

同一基因家族或同一基因由于不同剪接形式、翻译后修饰或基因拷贝数产生具有不同氨基酸序列和结构的蛋白质亚型，不同亚型可能在结构、功能或大小上存在一定差异，但由于它们共享一些相同的免疫原性位点，能被同一抗体识别 (Blijdorp et al., 2021)。例如，细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERKs）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族中的一员，主要包含两个经典亚型：ERK1（也称为MAPK3，分子量约为44 kDa），ERK2（也称为MAPK1，分子量约为42 kDa），二者在氨基酸序列上具有高度相似性。针对ERK的抗体可能同时识别ERK1和ERK2，因此在Western blotting实验中会出现两条带，分别对应ERK1和ERK2的不同分子量（图4）。

图4  ERK抗体识别ERK1和ERK2

4、蛋白质降解

作为生命活动的主要执行者，细胞内蛋白质的合成、折叠、修饰、定位、功能发挥以及降解等一系列过程始终保持在一个动态平衡的状态，以确保细胞功能的完整性。蛋白质稳态通过持续不断的合成和降解维持一个活性蛋白质库 (Rahman and Sadygov, 2017)。因此，当抗体同时识别完整蛋白质和其碎片时会在凝胶电泳中形成多个条带。

除此之外，在进行Western blotting实验时，整个实验流程的每一个步骤，包括胶的制备、电泳条件、转膜效率、封闭、抗体孵育等都需要严谨的操作和控制，任何环节的误差或不规范都可能增加非特异性背景或杂带的风险。

那么，当Western blotting实验中出现多个条带时，我们如何判断是蛋白自身因素还是因为抗体不特异呢？首先，我们需要明确什么是“特异”，特异性指的是抗体能够结合并仅与其目标抗原相结合的能力 (Pillai-Kastoori et al., 2020)。换言之，抗体应当识别并结合其靶蛋白，而不应与其它蛋白质结合。抗体特异性是评估抗体质量的最重要的标准之一，验证抗体特异性的方法有很多，其中基因工程是全球公认的最可靠的方法之一，也是最直接的方法，包括在DNA水平上的基因敲除（knockout，KO）以及通过小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）和短发夹结构RNA（short hairpin RNA, shRNA），在mRNA水平上对基因进行沉默或下调（knockdown，KD）。如果某个抗体在野生型（wild type，WT）细胞裂解物中能检测到信号，而在基因沉默或基因敲除的细胞裂解物中信号大幅减弱或消失，该抗体被认为特异性高。如图5，通过shRNA介导的基因沉默对前文多条带抗体进行验证，很显然，“杂带”并不“杂”。

图 5  shRNA介导的基因沉默对多条带抗体验证

参考文献：

1. Blijdorp, C.J., Tutakhel, O.A.Z., Hartjes, T.A., van den Bosch, T.P.P., van Heugten, M.H., Rigalli, J.P., Willemsen, R., Musterd-Bhaggoe, U.M., Barros, E.R., Carles-Fontana, R., et al. (2021). Comparing Approaches to Normalize, Quantify, and Characterize Urinary Extracellular Vesicles. J Am Soc Nephrol 32, 1210-1226. 10.1681/asn.2020081142.
2. Pillai-Kastoori, L., Heaton, S., Shiflett, S.D., Roberts, A.C., Solache, A., and Schutz-Geschwender, A.R. (2020). Antibody validation for Western blot: By the user, for the user. J Biol Chem 295, 926-939. 10.1074/jbc.RA119.010472.
3. Rahman, M., and Sadygov, R.G. (2017). Predicting the protein half-life in tissue from its cellular properties. PLoS One 12, e0180428. 10.1371/journal.pone.0180428.
4. Xu, L., Abd El-Aty, A.M., Shim, J.H., Eun, J.B., Lei, X., Zhao, J., Zhang, X., Cui, X., She, Y., Jin, F., et al. (2022). Design and Characterization of a Novel Hapten and Preparation of Monoclonal Antibody for Detecting Atrazine. Foods 11. 10.3390/foods11121726.
5. Xu, Q., Wang, Y., Chen, Z., Yue, Y., Huang, H., Wu, B., Liu, Y., Zhou, D.X., and Zhao, Y. (2023). ROS-stimulated protein lysine acetylation is required for crown root development in rice. J Adv Res 48, 33-46. 10.1016/j.jare.2022.07.010.